تحقیق و توسعه
مواد کشت بافت گیاهی برای ساخت محیط کشت دقیق
موفقیت در کشت بافت گیاهی فقط به کیفیت ریزنمونه یا تجهیزات آزمایشگاه وابسته نیست. ترکیباتی که برای ساخت محیط کشت استفاده میشوند مستقیماً شرایط تغذیهای و شیمیایی اطراف بافت گیاهی را تعیین میکنند و به همین دلیل انتخاب صحیح مواد اولیه، خلوص مناسب و آمادهسازی دقیق آنها اهمیت زیادی دارد.
در محیط کشت، سلول و بافت گیاهی باید بخش مهمی از عناصر مورد نیاز خود را از یک فرمول مشخص دریافت کند؛ از منابع نیتروژن و پتاسیم گرفته تا ویتامینها، کربوهیدراتها و در صورت نیاز تنظیمکنندههای رشد. به همین دلیل حتی تغییر یک ماده یا غلظت آن میتواند نتیجهای متفاوت ایجاد کند و فرمول مناسب باید بر اساس گونه گیاهی، نوع ریزنمونه و مرحلهای مانند استقرار، تکثیر یا ریشهزایی انتخاب شود.
در دسته مواد کشت بافت فردوس تجهیز میتوانید ترکیباتی مانند تیامین هیدروکلراید، پیریدوکسین هیدروکلراید، نیکوتینیک اسید، میواینوزیتول، گلایسین، پتاسیم نیترات، آمونیوم نیترات و اسید اسکوربیک را بررسی کنید. این مواد در فرمولاسیون محیطهای کشت یا در پروتکلهای تخصصی کشت بافت و تحقیقات گیاهی کاربرد دارند.
مواد کشت بافت گیاهی چیست؟
مواد کشت بافت گیاهی مجموعهای از نمکهای معدنی، ویتامینها، منابع کربن، اسیدهای آمینه، تنظیمکنندههای رشد و سایر مکملهایی هستند که برای تهیه محیط مناسب رشد سلول، بافت یا اندام گیاهی در شرایط In Vitro استفاده میشوند.
محیط مورد نیاز همه گیاهان یکسان نیست. به همین دلیل فرمولهای مختلفی برای کاربردهای متفاوت توسعه یافتهاند. یکی از شناختهشدهترین آنها Murashige and Skoog یا MS است که امروزه در طیف وسیعی از تحقیقات و فرآیندهای تکثیر گیاهی استفاده میشود.
Sigma-Aldrich محیط MS را یک محیط پرکاربرد برای کشت بافت گیاهی معرفی میکند و توضیح میدهد که ترکیب پایه آن شامل عناصر ماکرو و میکرو است و میتوان موادی مانند ویتامینها، ساکارز، آگار، آوکسینها و سیتوکینینها را بر اساس نیاز به آن اضافه کرد.
بنابراین هنگام خرید مواد کشت بافت، سؤال اصلی نباید فقط این باشد که «چه موادی لازم است؟» بلکه باید مشخص شود فرمول مورد استفاده چیست و هر ماده باید با چه غلظت و گریدی تهیه شود.
نمکهای معدنی؛ پایه تغذیه محیط کشت
بخش مهمی از محیطهای کشت را عناصر معدنی تشکیل میدهند. این مواد منابع عناصر ضروری را در اختیار بافت گیاهی قرار میدهند و معمولاً در دو گروه ماکرونوترینت و میکرونوترینت دستهبندی میشوند.
در میان محصولات فعلی فردوس تجهیز، پتاسیم نیترات و آمونیوم نیترات از ترکیبات مهم این بخش هستند. هر دو در فرمول کلاسیک MS حضور دارند. بر اساس فرمول منتشرشده Sigma، محیط MS کلاسیک حاوی آمونیوم نیترات و پتاسیم نیترات در کنار سایر نمکهای معدنی است.
وجود این مواد در یک محیط کشت به معنی امکان استفاده از یک مقدار ثابت برای تمام گیاهان نیست. حتی تولیدکنندگان تخصصی محیط کشت، نسخههای اصلاحشده MS با مقادیر کمتر یا حذف آمونیوم نیترات و پتاسیم نیترات ارائه میکنند؛ زیرا نیاز پروژهها و گونههای مختلف میتواند متفاوت باشد.
بنابراین اگر محیط کشت را از مواد اولیه تهیه میکنید، وزنکشی دقیق نمکها و پیروی از فرمول مرجع اهمیت زیادی دارد.
نقش ویتامینها در محیط کشت گیاهی
ویتامینها معمولاً در مقادیر بسیار کمتر از نمکهای معدنی استفاده میشوند، اما بخشی از فرمول بسیاری از محیطهای کشت گیاهی هستند.
در فرمول ویتامینی MS موادی مانند تیامین هیدروکلراید، نیکوتینیک اسید، پیریدوکسین هیدروکلراید، میواینوزیتول و گلایسین دیده میشوند. PhytoTech برای ترکیب کلاسیک ویتامینهای MS مقادیر مشخصی از این مواد را ارائه کرده است و همین مسئله نشان میدهد که این ترکیبات باید بر اساس فرمول محیط کشت وزنکشی شوند، نه بر اساس کاربرد عمومی یا تغذیه انسانی آنها.
فردوس تجهیز نیز در حال حاضر انواعی از تیامین B1، نیکوتینیک اسید B3، پیریدوکسین B6، میواینوزیتول و گلایسین را در این دسته عرضه میکند. برخی از این مواد با برند Sigma و برخی با برند GBG در سایت موجود هستند.
تیامین هیدروکلراید در کشت بافت
تیامین یا ویتامین B1 یکی از اجزای شناختهشده بسیاری از فرمولهای محیط کشت است. مقدار آن در محیطهای مختلف یکسان نیست؛ حتی ترکیب MS و Gamborg از نظر مقدار برخی ویتامینها با یکدیگر تفاوت دارند.
به همین دلیل هنگام خرید تیامین برای کشت بافت بهتر است علاوه بر خلوص، فرمول محیط و غلظت مورد نیاز در محلول Stock نیز بررسی شود.
پیریدوکسین و نیکوتینیک اسید
پیریدوکسین هیدروکلراید و نیکوتینیک اسید نیز در فرمولهای ویتامینی محیط کشت استفاده میشوند. در محیط MS کلاسیک هر دو در مقادیر کم حضور دارند، اما غلظت آنها در فرمولهای دیگری مانند Gamborg میتواند متفاوت باشد.
این نکته برای خرید اهمیت زیادی دارد؛ زیرا صرفاً یکسان بودن نام ماده به معنی یکسان بودن مقدار مصرف در تمام پروتکلها نیست.
میواینوزیتول؛ یکی از مکملهای متداول محیط کشت
Myo-Inositol از ترکیبات متداول در بسیاری از محیطهای کشت گیاهی است و در فرمول کلاسیک MS نیز وجود دارد. Sigma در فرمول MS خود مقدار مشخصی از میواینوزیتول را در کنار ویتامینها ذکر کرده است.
فردوس تجهیز میواینوزیتول مخصوص Plant Cell Culture را در گزینههای Sigma و GBG عرضه میکند.
هنگام تهیه Stock Solution نیز باید به اطلاعات سازنده توجه شود. PhytoTech برای نمونه اشاره میکند که میواینوزیتول موجود در محلول ویتامینی MS ممکن است در دمای پایین رسوب کند و با گرم کردن ملایم و همزدن دوباره حل شود.
این نمونه نشان میدهد که Solubility و شرایط نگهداری ماده به اندازه نام و خلوص آن اهمیت دارد.
گلایسین در فرمول محیط کشت
گلایسین یکی دیگر از ترکیبات موجود در فرمول ویتامینی MS است. برخلاف توضیح عمومی درباره نقش گلایسین در بدن انسان، آنچه برای صفحه فروش مواد کشت بافت اهمیت دارد، جایگاه این ماده در فرمول محیطهای گیاهی است.
PhytoTech در ترکیب ویتامینهای MS وجود گلایسین را در کنار تیامین، پیریدوکسین، نیکوتینیک اسید و میواینوزیتول تأیید میکند.
بنابراین برای صفحه محصول گلایسین فردوس تجهیز نیز پیشنهاد میشود توضیح انسانی فعلی حذف و محتوایی بر اساس کاربرد آزمایشگاهی و محیط کشت گیاهی جایگزین شود.
اسید اسکوربیک در کشت بافت چه کاربردی دارد؟
اسید اسکوربیک یا ویتامین C الزاماً جزء ثابت همه محیطهای پایه نیست، اما در برخی پروتکلها بهعنوان آنتیاکسیدان مورد استفاده قرار میگیرد.
یکی از مشکلات رایج در برخی ریزنمونهها، اکسید شدن ترکیبات فنلی و تیره شدن بافت است. FAO در پروتکلهای کشت بافت گیاهی به استفاده از آنتیاکسیدانهایی مانند اسید اسکوربیک یا اسید سیتریک در برخی شرایط برای کاهش سیاهشدگی اشاره کرده است. مقدار و روش مصرف باید بر اساس گونه و پروتکل انتخاب شود و نمیتوان یک دوز ثابت را برای تمام کشتها پیشنهاد کرد.
فردوس تجهیز اسید اسکوربیک را در گزینههای Sigma و GBG ارائه کرده است.
هنگام خرید مواد کشت بافت به چه مشخصاتی توجه کنیم؟
در پروژههای تحقیقاتی و تکثیر تجاری، کوچکترین تفاوت میان دو Batch مواد اولیه ممکن است نیازمند بررسی باشد. به همین دلیل بهتر است خرید مواد فقط بر اساس قیمت انجام نشود.
مهمترین موارد عبارتاند از:
- نام و فرمول شیمیایی دقیق ماده: بهخصوص برای نمکها و ترکیبات دارای فرمهای مختلف.
- گرید و کاربرد محصول: برای کارهای حساس، محصولی انتخاب شود که مشخصات آن با Plant Cell Culture یا کاربرد آزمایشگاهی مورد نظر سازگار باشد.
- درصد خلوص: مقدار اعلامشده باید با نیاز پروتکل مطابقت داشته باشد.
- برند و شماره کاتالوگ: در پژوهشهایی که باید قابل تکرار باشند، ثبت دقیق Product Number و Lot اهمیت دارد.
- Certificate of Analysis یا COA: برای بررسی مشخصات همان بچ تولیدی مفید است.
- شرایط نگهداری: دما، نور و رطوبت مناسب برای همه مواد یکسان نیست و باید طبق Datasheet همان محصول رعایت شود.
- حلالیت: بعضی ترکیبات برای تهیه محلول Stock به شرایط یا حلال مشخص نیاز دارند.
- تاریخ انقضا و وضعیت بستهبندی: مخصوصاً در موادی که به رطوبت یا نور حساس هستند.
تولیدکنندگان تخصصی مواد کشت بافت نیز روی کنترل مشخصات فیزیکوشیمیایی، تست زیستی و قابلیت ردیابی Lot تأکید میکنند.
آمادهسازی محیط کشت؛ دقت در وزنکشی و pH
حتی بهترین مواد اولیه اگر اشتباه آماده شوند، الزاماً محیط کشت مناسبی ایجاد نمیکنند.
Sigma در پروتکل آمادهسازی محیط پیشنهاد میکند مواد طبق فرمول حل شوند، مکملهای مورد نیاز افزوده شوند و سپس pH به مقدار مورد نظر پروتکل تنظیم شود. برای یک محیط MS مشخص، عددی در حدود 5.7±0.1 بهعنوان نمونه ارائه شده است؛ اما این مقدار نباید بدون بررسی برای تمام محیطها و گونههای گیاهی تعمیم داده شود.
اگر محیط دارای عامل ژلکننده باشد، نحوه حل شدن آن نیز اهمیت دارد. همچنین ترکیبات حساس به حرارت باید بر اساس دستور سازنده یا پروتکل، پس از استریلسازی و بهصورت آسپتیک اضافه شوند. Merck صراحتاً توصیه میکند مواد Heat-Labile پس از اتوکلاو به محیط افزوده شوند.
مواد کشت بافت برای چه مراکزی کاربرد دارند؟
این محصولات محدود به یک آزمایشگاه دانشگاهی نیستند. مواد اولیه محیط کشت در مجموعههای مختلفی استفاده میشوند؛ از جمله آزمایشگاههای بیوتکنولوژی گیاهی، واحدهای ریزازدیادی و Micropropagation، مراکز اصلاح نباتات، پژوهشگاههای کشاورزی، پروژههای کشت سلول گیاهی و مجموعههایی که روی تولید یا تکثیر گیاهان در شرایط کنترلشده فعالیت میکنند.
FAO نیز در منابع مربوط به آزمایشگاههای Micropropagation بر وجود بخش مشخص برای آمادهسازی محیط و گیاه، انتقال و نگهداری کشت تأکید میکند؛ یعنی کیفیت مواد اولیه تنها بخشی از یک فرآیند کنترلشده کامل است.
قیمت مواد کشت بافت به چه عواملی بستگی دارد؟
قیمت مواد کشت بافت گیاهی بر اساس نوع ترکیب، برند، گرید، درصد خلوص، وزن بستهبندی و شرایط تأمین متفاوت است. برای مثال قیمت یک ماده Sigma با همان نام شیمیایی از یک برند دیگر ممکن است یکسان نباشد؛ زیرا مشخصات محصول، تستها و مستندات همراه آن میتوانند متفاوت باشند.
برای مقایسه صحیح، بهتر است ابتدا نام دقیق ماده، گرید، درصد خلوص و مقدار مورد نیاز مشخص شود و سپس قیمت گزینههای مشابه با یکدیگر مقایسه شود.
خرید مواد کشت بافت از فردوس تجهیز
اگر برای تهیه محیط کشت گیاهی به مواد پایه نیاز دارید، در این دسته از فردوس تجهیز میتوانید ترکیباتی مانند تیامین هیدروکلراید، نیکوتینیک اسید، پیریدوکسین هیدروکلراید، میواینوزیتول، گلایسین، پتاسیم نیترات، آمونیوم نیترات و اسید اسکوربیک را بررسی کنید.
بهتر است پیش از سفارش، فرمول محیط کشت، مقدار مورد نیاز و برند یا Grade مورد نظر مشخص شود. در پروژههایی که پروتکل مشخصی دارند، ارائه نام محیط و ترکیبات مورد نیاز نیز میتواند انتخاب محصول را سادهتر کند.
در کشت بافت، خرید ماده صحیح با مشخصات صحیح بسیار مهمتر از تهیه صرف یک ترکیب با نام مشابه است؛ زیرا هدف نهایی، ایجاد محیطی قابل تکرار و متناسب با نیاز واقعی بافت گیاهی است.
سوالات متداول درباره مواد کشت بافت
مواد اصلی مورد استفاده در محیط کشت گیاهی کداماند؟
بسته به فرمول، محیط میتواند شامل نمکهای ماکرو و میکرو، ویتامینها، منبع کربن، اسیدهای آمینه، تنظیمکنندههای رشد و در محیطهای جامد عامل ژلکننده باشد. ترکیب دقیق باید از پروتکل محیط مورد استفاده استخراج شود.
MS Medium چیست؟
Murashige and Skoog یا MS یکی از محیطهای بسیار پرکاربرد کشت بافت گیاهی است که ترکیبی مشخص از عناصر ماکرو و میکرو دارد و میتواند با ویتامینها، ساکارز، عوامل ژلکننده و تنظیمکنندههای رشد تکمیل شود.
آیا مقدار ویتامینها در همه محیطهای کشت یکسان است؟
خیر. حتی محیطهای MS، LS و Gamborg از نظر ترکیب یا مقدار برخی ویتامینها تفاوت دارند؛ بنابراین باید فرمول دقیق پروتکل رعایت شود.
برای محیط کشت میتوان از هر نوع ماده شیمیایی استفاده کرد؟
بهتر است Grade، خلوص، مستندات محصول و سازگاری آن با کاربرد مورد نظر بررسی شود. محصولات مخصوص Plant Cell Culture معمولاً برای این کاربرد مشخص ارزیابی شدهاند.
چرا pH محیط کشت مهم است؟
pH بر شرایط شیمیایی محیط و عملکرد آن اثر دارد و باید طبق فرمول یا پروتکل تنظیم شود. Sigma برای آمادهسازی یکی از محیطهای MS مقدار حدود 5.7±0.1 را ذکر میکند، اما مقدار مناسب باید برای محیط مورد استفاده بررسی شود.